初发膀胱癌术后预后预测-无创液体活检CTC

      膀胱癌仅限于膀胱粘膜表面，称为浅表性膀胱癌（非肌层浸润性膀胱癌NMIBC），是膀胱癌最易于治疗的肿瘤阶段，可选择经尿道保膀胱手术。大约75%的膀胱癌在这个早期阶段被发现，存活率大于90%。多达70％的NMIBC患者最终会出现疾病复发，而10–20％的患者会经历疾病发展为肌肉浸润性膀胱癌（MIBC）。如果及时采取适当的治疗措施，总体生存率通常仅受到轻微影响。临床上有些患者从未经历过疾病复发，但另外一批患者则经历了肿瘤进展并最终死于膀胱肿瘤。前期已确定一些危险因素，特别是在肿瘤复发和进展风险高的NMIBC患者中，以优化关于辅助治疗的治疗建议。此外找出肿瘤进展风险最高的NMIBC患者，给予更早更积极的治疗（包括根治性膀胱切除术和围手术期全身化疗）至关重要。
      目前预测个体疾病复发和进展的短期和长期风险仍主要基于临床和标准组织病理学参数。肿瘤细胞向外周血中的扩散是肿瘤进展过程中的重要步骤，也是发生远处转移的前提。CTC是在循环中捕获的恶性上皮细胞，可能代表微转移性疾病。与其他单核血细胞相比，CTC非常罕见。理论上将CTC假定为微转移疾病的替代物可能会改变NMIBC中的治疗方案。虽然NMIBC通常被认为可以通过局部治疗而无需全身化疗来控制，但NMIBC中存在CTC可能表明需要更激进的治疗或全身化疗。因此在NMIBC中检测出CTC具有巨大的潜力更精确的分期和预后预测。确实在数项研究中已经研究了CTC在肌层浸润性和转移性膀胱癌中的影响，但是它们在早期膀胱癌中的优势仍然不清楚。液体活检的概念推动了令人鼓舞的机会，无需传统的活检或原发肿瘤或其转移的手术切除即可发现和监测疾病以及治疗反应。我们总结并讨论了CTC在NMIBC中的当前价值。CTC通过无创实时技术进行动态疾病监测和反应监测。
        CellSearch®是一个标准化的CTC检测平台，即半自动CellSearch®系统，该方法已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准，可用于分析转移性乳腺癌、前列腺癌和大肠癌患者的血液。通过CellSearch®，可使用包被于铁纳米颗粒的上皮细胞粘附分子（EpCAM）抗体通过阳性选择从静脉血中富集CTC。已证明膀胱根治切除术标本中有96％的膀胱肿瘤表达EpCAM。为了鉴定CTC：将富集的细胞用抗角蛋白抗体进行免疫染色。4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）用于细胞核染色，CD45阳性排除白细胞。随后自动荧光显微镜扫描选定的细胞，并由经验丰富的肿瘤生物学家对所呈现的图像进行进一步评估。要被分类为CTC，选定的细胞必须符合特定的形态学标准，包括最小直径4μm，圆形或椭圆形以及细胞质内可见的核。大量研究表明，CellSearch®对CTC检测具有很高的灵敏度，特异性和可重复性。在FDG-PET-CT成像研究中，CTC的存在似乎与转移性疾病有关。此外，已经建立了CTC的进一步表型和分子表征，包括抗原分析，这可能与靶向治疗有关，例如人表皮生长因子受体（HER2），程序性死亡配体-1（PD-L1），以及使用荧光原位杂交（FISH）和/或基于PCR的技术分析转录组和基因组畸变。但是标准化的CellSearch®系统存在关键局限性：该测定法可能无法检测出完全丧失EpCAM和/或角蛋白表达的细胞，这种情况在上皮-间质转化（EMT）期间发生。在UCB和其他实体恶性肿瘤中，EMT对于转移过程至关重要。因此，CellSearch®可能会错过最有趣的细胞。因此，需要CTC捕获独立于EpCAM表达的测定法。
        CELLection™上皮细胞富集Dynabeads®与CellSearch®相对应，CELLection™上皮细胞富集Dynabeads®是另一种依赖EpCAM的检测方法，用于CTC的阳性选择富集和检测。Dynabeads®是直径4.5µm的均匀的超顺磁性聚合物微珠，并涂有单克隆EpCAM抗体。与CellSearch®相反，随后将捕获的细胞裂解，并使用RT-PCR分析CD45和角蛋白的表达。CTC被定义为没有CD45表达的角蛋白阳性细胞。
        AccuCyte®-CyteFinder®是使用两种互补技术的独立于EpCAM的基于密度的细胞分离平台。AccuCyte®系统使用独特的分离管和收集器设备将白细胞层与红细胞和血浆分离。整个白细胞层被完全收获，没有细胞裂解或洗涤步骤，这可能会导致大量相关的CTC损失。CyteFinder®是一种自动扫描数字荧光显微镜和图像分析系统，可在用特异性抗体（例如抗EpCAM，抗EGFR，抗CD45，抗角蛋白）染色后对细胞进行成像。在明确分类为CTC后，使用集成的CytePicker™设备检索CTC，这些细胞可以通过基因组分析进一步表征。AccuCyte®-CyteFinder®已被用于前列腺癌和膀胱癌中CTC的检测和定性。
        在TURBT（经尿道膀胱肿瘤电切）术中当切除血管时，癌细胞释放到冲洗液和尿液同时，并有可能进入血液。对于肌层浸润性膀胱癌MIBC和非肌层浸润性膀胱癌NMIBC患者，TURBT本身可能导致一定数量的CTC进入血管系统。与从外周静脉中抽出的血液相比，从下腔静脉置管抽出的血液中检测到的CTC数量更高。然而，目前尚不确定术中释放CTC的肿瘤学影响。在进行TURBT之前，部分NMIBC患者中可检测到CTC。在大多数研究中，CTC的存在与NMIBC的临床病理特征无关。
      使用CELLection™检测，在54例pT1高级别UCB（膀胱尿路上皮癌）患者中，有44％的患者存在CTC：总共有92％的CTC通过RT-PCR测定显示出survivin的表达,在表达survivin的CTC患者中，82％的患者膀胱肿瘤组织中表达survivin。在多变量分析中，阳性的CTC状态是降低无复发生存率的独立危险因素，该队列的长期随访评估（中位随访：9年）证实，CTC阳性与无复发生存率降低相关（CTC+vs.CTC-：23vs.89个月；P值<0.001）。
      使用CellSearch®进行的其他研究表明，在18-20％的NMIBC患者中存在CTC，平均每7.5mL血液中CTC数为1-1.5。中位随访长达24个月后，CTC阳性与肿瘤学预后较差有关，即无复发和无进展生存期减少。CTC的存在与肿瘤分期增加有关，因为在8例pT1患者中发现了CTC（32％），而在pTa肿瘤患者中没有发现CTC（80）。另外，CTC的存在与原位癌（CIS）的存在相关，因为在5例患有CIS的患者（62.5％）和3例没有CIS的患者（8.3％）中发现了CTC（80）。在Kaplan-Meier分析中，与CTC阴性的患者相比，存在CTC的患者的无复发生存期减少（6.5vs.21.7个月；P值<0.001）。        

         在当前最大的规模（包括102名接受TURBT加膀胱内BCG免疫疗法治疗的高危pT1膀胱癌患者）的前瞻性研究中，CTC阳性与多种临床病理特征相关，即女性、肿瘤大小超过3cm、原位癌CIS的存在、肿瘤的多灶性和淋巴管浸润（LVI）的存在。在针对既定结局预后因素进行调整的多变量分析中，CTC的存在是降低无复发生存率的独立预测因素和无进展生存期的最强预测因子。此外，阳性CTC状态对疾病进展的阳性和阴性预测值分别为75％和93％。
      最近一项比较两种检测方法之间CTC检出率的研究发现：在155名接受TURBT治疗的NMIBC高危患者中，CELLection™（44.4％）比CellSearch®（19.8％）更高。101位患者（65.2％）使用CellSearch®分析外周血，54位患者（34.8％）使用CELLection™分析外周血。两组组之间，年龄，性别，CIS的存在，肿瘤多灶性和肿瘤大小没有差异。用CELLection™和CellSearch®检测到的CTC都对疾病的复发和疾病的发展产生负面影响。然而，作者认为尽管很难比较这两种方法的信度和功效，但CellSearch®似乎更可靠、更有效地展示CTC与无复发和无进展生存相关。因此，特别是在患有高风险NMIBC的患者中，CTC可能有助于识别那些需要更积极治疗（例如全身化疗和/或早期膀胱根治术）的患者。
      由83位患者和29位对照组成的膀胱癌队列中，AdnaTest®在6.7％的NMIBC患者，15％的MIBC患者和18.7％的转移癌患者中检测到CTC：在NMIBC患者中分别有6.7％，3.3％和10％的患者存在上皮标记HER2，EMT相关标记PI3Kα和肿瘤干细胞相关标记ALDH1的转录本。作者认为在缺少上皮转录物的患者中检测到干细胞相关的转录物以及与EMT相关的转录物可能表明存在上皮标记依赖方法可能会漏掉的CTC亚组。
       为了规避依赖EpCAM的CTC富集筛选，一种新颖的方法即无需选择的AccuCyte®-CyteFinder®系统。该方法允许使用高通量成像来识别EpCAM阴性和EpCAM阳性CTC，而无需为CTC捕获进行初始选择步骤。该平台在29例患有非肌肉浸润NMIBC、肌肉浸润MIBC和转移的膀胱癌患者中检测到CTC。当将CTC定义为任何角蛋白阳性和白细胞标记阴性细胞时有25％的NMIBC患者存在CTC。有趣的是所有存在CTC的NMIBC患者都患有pT1疾病。相反当使用更严格的CTC定义和对EpCAM阳性的额外要求时，在任何NMIBC患者中均未检测到CTC。有必要进行进一步的研究以评估该测定法的预后效用，尤其是进一步表明没有EpCAM表达的CTC对生存的影响。