过表达HIF-1α诱导人前列腺癌干细胞发生EMT转化的研究

前    言

 

前列腺癌（prostate cancer, PCa）是西方男性常见的恶性肿瘤，死亡率居肿瘤致死率的第二位[1]，在我国其发生率也在逐年升高。发生远处转移是晚期前列腺癌致死的主要原因：未发生转移者五年生存率几乎100%，而发生转移的患者五年生存率只有30%左右。因此肿瘤转移机制的阐明对于肿瘤患者的治疗及预后意义重大。由于前列腺癌生物学行为十分复杂，目前对于其转移机制并不是十分清楚。北京安贞医院泌尿外科林云华

肿瘤转移是一个复杂的、多步骤的阶段演变过程。肿瘤细胞要完成转移过程，必须经历从原发瘤中脱落、进入血管和（或）淋巴管、在循环中生存、黏附于继发器官微血管、渗出血管和（或）淋巴管、进入继发器官组织、形成微转移瘤并诱发血管发生，最终形成转移瘤，任一环节的中断均不能形成转移瘤。事实上，90％的转移细胞能够完成转移过程早期的一个或多个步骤，约2％的肿瘤细胞能够形成微转移瘤，而仅有约0.2％的肿瘤细胞能够有效诱发血管生成最终形成转移瘤。肿瘤细胞之间存在非常大的异质性，只有非常小的一部分细胞可以最终形成转移瘤，这部分细胞有可能承载着肿瘤的发生、复发和转移，被称为肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）。肿瘤干细胞在驱动肿瘤发生和转移方面起着决定作用。

上皮间质样转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是近年来兴起的阐述上皮来源肿瘤转移机制的新理论。EMT是指上皮细胞向间质细胞转化的一种中间状态。这一理论最初用来解释胚胎发育的过程，直到2000年研究人员将这一理论引入肿瘤转移机制的研究，肿瘤原位脱离现象才得以揭开神秘的面纱。近年来的研究表明：EMT参与了肿瘤恶性表型转化的启动过程，是肿瘤开始转移的关键步骤。EMT不仅在肿瘤转移的启动中起到重要作用，而且与CSC的关系极为密切，但二者之间的具体关系尚不清楚。

目前已有研究发现，肿瘤上皮细胞在EMT阶段中，肿瘤内部出现了一些具备干细胞特性（分子生物学特性和行为学特性）的细胞亚群。一些学者认为EMT可能是促进CSC产生的动力因素。也有部分研究表明在无CSC的环境里，若诱导肿瘤细胞发生EMT，新的CSC成分会出现。所以我们推测，EMT与CSC发生的过程可能是同步的。在某个未知的细胞群体里，如果出现基因的改变，可能同时出现两个程序基因的启动，意味着CSC内部可能存在EMT发生的易感基因。我们的实验就是为了研究CSC是否比非干细胞更容易发生EMT现象。

本课题以前列腺癌干细胞为研究目标，为了阐明EMT和肿瘤干细胞的关系，说明肿瘤干细胞在EMT过程中扮演的角色，以期了解EMT现象和肿瘤干细胞在肿瘤转移中的作用，为前列腺癌干细胞与前列腺癌发生、复发和转移关系研究打下一定基础。

 

正    文

 

一、研究背景

 

干细胞（Stem Cells）

干细胞的研究起始于19 世纪60 年代，最初的发现是源于两位科学家：Ernest A. McCulloch 和James E. Till 及他们的团队在研究正常血液系统的产生和恶变的过程中发现一种细胞可以自我复制并产生由多种细胞组成的克隆[2, 3]。这种细胞就是造血干细胞。干细胞存在于所有多核细胞生物中。干细胞区别于普通细胞之处是它们可以通过有丝分裂自我复制并且能够分化产生更为成熟的子代细胞[4]。自我复制是指，在特殊的细胞分裂之后，干细胞产生另外一个与它功能相同的干细胞。通过自我复制，干细胞保证了自身的数量。分化是指，干细胞分裂产生具有特定功能的成熟的子代细胞。干细胞通过这两种特殊的分裂方式实现了组织和器官的生长和损伤后的修复。

干细胞大致可以分为三种：胚胎干细胞、生殖干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞是从胚胎的内细胞团中分离出来。它们保留了完整的全能性，可以分化为各个组织和器官的细胞[5, 6]。生殖干细胞产生精子和卵子，携带了形成胚胎干细胞的重要的遗传物质[7]。成体干细胞被发现于成体组织中。它们只保留了部分的多能性，通常只能分化成具有某类功能的体细胞[8-13]。在成人体内，干细胞和祖细胞充当着人体内的损伤修复系统，补充体细胞的缺失。部分器官的干细胞可以在损伤后实现组织器官的再生。

干细胞的研究吸引了大批科学家，不仅是因为它们神奇的多项分化和自我复制的特性，而且在于干细胞有着重要的医疗价值，有可能作为组织器官再生的重要来源[14-16]。人们可以通过特定的培养方法将干细胞诱导分化成不同类型的组织细胞[17-19]。其中，骨髓和脐带血中的具有高度可塑性的干细胞被广泛地应用于临床的治疗中，极大地推动了再生医学的发展[20-23]。不仅如此，干细胞与肿瘤之间有着极其重要并且微妙的联系已经成为科学领域的共识。肿瘤细胞可以不断地自我复制、分化程度低、有侵袭转移的能力等等，这些特点都让人们不难把它和干细胞相互联系[24-26]。近些年，随着肿瘤干细胞理论的逐渐完善以及大量实验证据的出现，肿瘤细胞与干细胞的关系更为引人关注。

 

肿瘤干细胞（Cancer Stem Cells, CSCs）

肿瘤最初起源于发生突变的正常细胞，这些细胞获得了恶性增殖的能力，并最后发生恶性转化。新生的癌细胞克隆性生长并获得转移的能力。在癌症生物学中，一个中心的问题是，哪些细胞可以发生恶性转化形成肿瘤，哪些细胞又是肿瘤转移的罪魁祸首[27]。CSCs假说认为，在肿瘤组织中存在一个类似于干细胞的细胞亚群，它们不仅可以自我复制并且可以分化产生异质性的肿瘤细胞。肿瘤组织中的这个细胞亚群被称作CSCs或TICs[28, 29]。类似于成体干细胞，CSCs 有无限增殖的能力，可以产生更多的CSCs和子代细胞。子代细胞可以最终分化成肿瘤组织中不同类型的肿瘤细胞。CSCs是肿瘤发生的源头，也是推动肿瘤生长的动力。

自从1971年Park从小鼠腹水中成功分离出骨髓瘤干细胞，肿瘤干细胞假说才真正成为一种科学理论，开辟了肿瘤干细胞研究的崭新局面。随后Dick[30]成功地分离出CD34+CD38−的急性髓系白血病干细胞、Al-Hajj[31]从乳腺癌组织中分离出CD44+CD24−人乳腺癌干细胞、Singh从多种脑肿瘤组织中也鉴定出了CD133+nestin+脑肿瘤干细胞[32]。2005年底Cancer Research杂志发表了另一篇重要的学术论文[33]，正式报告了Collins从人前列腺癌组织中成功分离出前列腺癌干细胞，确认了其独特的细胞表面抗原表型为CD44+/α2β1high/CD133+，并证实这种表型细胞有显著的自我更新能力和高度增殖潜能，可以分化为多种类型的表达雄激素受体和酸性磷酸酶的前列腺癌细胞，为前列腺癌转移机制的深入研究作了重要铺垫。CSCs的共同特点是：它们能够以较少的数量、在较短的时间内，在免疫缺陷小鼠体内形成与原肿瘤组织类似的新的肿瘤；它们具有自我复制和分化的潜能，表达类似干细胞的基因，并且对放化疗具有更强的抵抗能力。CSCs假说倍受关注的原因在于它在很大程度上颠覆了以前人们对于肿瘤的认识。传统理论认为：肿瘤虽然是由不同亚群的肿瘤细胞所组成，但是不同亚群之间没有等级上和功能上的差别；在肿瘤的复发和转移中，各个亚群的机会是均等的和随机的。但是，CSCs假说则认为肿瘤细胞亚群存在功能上的异质性，不同亚群之间有着等级的划分，它们在肿瘤的发生发展中扮演着不同的角色，肿瘤的生长、治疗后的复发和转移可能都是依赖这种具有自我复制和分化能力的CSCs。它们就像肿瘤中的“种子”，只有彻底消灭CSCs，才可能根除肿瘤，获得康复[34]。如果这一假说在人体内获得充分证实，那么它将对肿瘤的治疗产生极其重要的影响。肿瘤的治疗理念和抗癌药物的开发研制都将发生革命性的改变。传统治疗是以肿瘤体积的变化作为衡量治疗效果的标准。抗肿瘤药物也是基于肿瘤体积的改变筛选出来的。基于CSCs理论的治疗可能将以CSCs为靶点，彻底清除肿瘤复发和转移的根源[35]。这给癌症的攻克带来了曙光。

对于CSCs作用机制的了解正在加深，越来越多与CSCs功能联系密切的分子被发现。CSCs与正常的干细胞有很多相似的调控机制。Piccirillo SG等发现，骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins，BMPs）通过激活Smad信号通路抑制恶性神经胶质细胞瘤干细胞的自我复制、促进其分化。BMP4处理后的CSCs克隆形成能力下降，表达CD133+的细胞群体减少，即恶性神经胶质细胞瘤的干细胞池（the pool of stem cells）减小。这些都表明，BMPs-Smad信号通路不仅控制着正常大脑干细胞的活性，也是神经胶质细胞瘤干细胞的重要的抑制因子[36]。此外，BMI-1（PCGF4）通过抑制Ink4a在白血病干细胞和正常干细胞的自我复制中都扮演重要角色。而且，在BMI-1−/−的小鼠中可以发生急性粒细胞白血病（AML），但是这种老鼠的白血病干细胞的自我复制能力却受到了很大影响，说明BMI-1可能调控了CSCs的自我复制[37, 38]。Sonic Hedgehog (Shh)也是维持CSCs自我复制能力的重要基因。抑制Shh信号通路不仅可以减少白血病干细胞的比例，而且可以增加其对化疗药物Imatinib的敏感性[39]。另外，在多发性骨髓瘤中，Hedgehog的配体促进了多发性骨髓瘤干细胞的扩增，并且抑制了它们的分化；Shh通路被抑制时，与普通瘤细胞相比，瘤干细胞的克隆扩增受到更大的抑制[40]。

 

侧群（Side Population，SP）细胞

SP细胞可以排出DNA染料Hoechst33342呈现较低的荧光信号。它们在流式细胞检测中出现在主要细胞群落的旁边因而被命名为SP细胞。SP细胞首先在血液系统被发现，它们表现出了造血干细胞的特性—重建血液系统。因此，对于SP细胞的研究成为研究造血干细胞的重要手段之一。近些年，在多种肿瘤组织和细胞系中也分离和鉴定出了SP 细胞，它们呈现出了CSCs的特点。Chiba T 等在多种肝癌细胞系中分离出了SP细胞[41]。他们发现，SP 细胞在两种肝癌细胞系Huh7 和PLC/PRF/5 中占所有细胞比例的0.25%~0.80%。SP细胞比非SP（non-SP，NSP）细胞表现出了更强的增殖潜能和抗凋亡的特性。SP细胞只需要1 × 103 就可以在小鼠体内成瘤，而NSP 细胞却需要超过1 × 106。SP细胞在连续移植实验中都可以形成肿瘤，并且可以产生SP 和NSP 两种细胞，这说明SP 细胞具有自我复制和分化的能力。在肺癌中，Ho MM 等对6 株肺癌细胞系(H460, H23, HTB-58, A549, H441, 和H2170)进行了研究[42]。他们发现，SP细胞有着更强的异种成瘤能力和侵袭能力，表达ABCG2在内的多种ABC转运泵，能够抵抗多种化疗药物。而且，SP细胞表达活性更强的端粒酶，提示它们可能具有无限增殖的能力。DNA复制必须的MCM (minichromosome maintenance)的基因表达水平低于NSP细胞，说明SP细胞可能多数处于G0期。在食管癌中，Huang D等在食管癌细胞系EC9706和EC109中分离出了SP细胞，并且发现SP细胞比NSP细胞具有更强的克隆形成能力。在异种成瘤实验中，SP细胞的成瘤能力要远强于NSP细胞。芯片分析Real-Time PCR显示，SP细胞有着与NSP细胞不同的基因表达谱，并且高表达多种“干性相关基因”（包括OCT-4、SOX-2、BMI-1、和ZFX）、两个ABC 转运泵（ABCG2 和ABCA5）和多个Wnt、Notch 相关通路的基因（FZD10、PTGS2、KLF5、TTK 和RBM15）[43]。在间质肿瘤中，Wu C等在对29个间质肿瘤的研究中发现，SP细胞的异种成瘤能力强于NSP细胞，并且只有SP细胞形成的肿瘤才能在连续移植实验中形成新的肿瘤。不仅如此，随着肿瘤的恶性程度增加SP细胞的比例也逐渐增加，说明SP细胞在肿瘤中的比例可能可以对肿瘤的分期及病人的预后有所提示[44]。

关于ABCG2/BCRP1在SP细胞中是否特异性表达，目前仍然存在争议。Zhou S等在研究中发现ABCG2在造血干细胞的表达是特异的：在老鼠的原代造血干细胞中，ABCG2的表达是增高的，并随着分化而降低；增加ABCG2的cDNA可以使造血干细胞比例增加，减少其分化[45]。但是，在脐带血干细胞的研究中，Alt R等发现，尽管SP细胞的克隆形成能力是对照组的20倍，但却不表达ABCG2 基因。磁珠分选出的ABCG2+细胞的克隆形成能力、SP细胞的比例、干细胞的免疫标记与对照组并没有显著差别。ABCG2基因在SP细胞和CD133+（脐带血干细胞相关的表面标记）细胞中都没有更高表达[45]。而且，在CSCs的研究中，Patrawala L等对多种人类癌症细胞系和异种移植的肿瘤的研究中发现，SP细胞比NSP细胞有更强的成瘤能力，具有自我复制和分化的特性，表达干性基因（Notch-1和β-catenin）。但是对于ABCG2的研究中，他们发现，尽管SP细胞比NSP细胞表达更高的ABCG2，并且ABCG2 基因在他们研究的所有人类癌症细胞系和异种移植的肿瘤中的比例很低（0.5-3%），分选富集的ABCG2+细胞的成瘤能力与ABCG2－细胞并没有明显区别。不仅如此，ABCG2+的细胞可以产生ABCG2－的细胞，同样，ABCG2－的细胞也可以产生ABCG2+的细胞。更为奇怪的是，ABCG2－的细胞在克隆形成实验中比ABCG2+的细胞形成克隆的能力更强，并表达更多的干性基因[46]。

 

上皮细胞间质转化态（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）

EMT是指上皮细胞向间质细胞转化的一种中间状态。EMT现象是胚胎发育过程中的重要生理现象：上皮源胚胎干细胞经历EMT转化过程后获得了周围间叶细胞所特有的“运动潜能”，“迁移”至“预定”的发育部位，最终生发成器官。随着胚胎发育的成熟，EMT现象逐渐消失。但是在肿瘤发生及转移过程中，EMT现象又重新出现[47]：上皮起源的恶性肿瘤细胞在与周围间质的相互作用过程中，①逐渐丢失上皮细胞的部分特征（如上皮属性蛋白E-cadherin表达下调），失去细胞间粘附作用；②同时获得间质细胞的某些特殊属性（如反常表达间质细胞特异蛋白Vimentin、N-cadherin、Fibronectin）；③细胞骨架改变，细胞外形演变为纺锤形纤维细胞形态，适应运动需要。通过这三个环节的自身调整，肿瘤细胞逐渐“进化”为具有强大运动能力的间质样细胞，并从原位瘤灶脱落，继而入侵周围组织间隙及脉管系统，最终导致肿瘤远处转移的结局。对于上皮恶性肿瘤，EMT是肿瘤转移过程中的起始步骤。

EMT理论揭示了“肿瘤细胞自身属性改变致转移能力增强”的本质，近年来受到学术界的广泛关注。同时越来越多的研究证实EMT是肿瘤恶性表型转化的基础过程和关键步骤：①多种实体肿瘤周围的间质细胞中，有部分细胞表达上皮标志，这些病理学检查通常忽略的“间质样”细胞，其实就是发生EMT改变的上皮源癌细胞[48]；②另外，从前列腺癌、乳腺癌、结肠癌骨转移灶中收集到的癌细胞均被发现表达有间质细胞标志蛋白[49]；③此外发现，乳腺癌微转移瘤灶中癌细胞骨架已明显改变，E-cadherin表达缺失，证实这些细胞已发生EMT改变。而在原位瘤灶中，也发现了这种“变性”细胞，并且这种转变同癌细胞的恶性行为高度相关[50]；④近来在甲状腺癌中也发现，瘤体边缘侵袭区细胞已完成了EMT转变[51]。这些证据均表明：EMT参与了肿瘤恶性表型转化的启动过程，是肿瘤开始转移的关键步骤。

最近有研究表明EMT和普通细胞获取干细胞性能存在着必然联系[52]。上皮细胞在EMT阶段中，除了获取侵袭迁移能力外还具备了部分干细胞特性。Mani和她的同事研究人永生化乳腺上皮细胞（HIMEL）时发现，TGF-β培养12天或转染Snail、Twist等诱导上皮细胞发生EMT后，细胞系中CD44+/CD24−细胞亚群比例升高，体外实验证实乳腺小球生成能力增强，提示EMT过程伴随着已分化细胞干细胞特性的获得[53]。肿瘤细胞与巨噬细胞等骨髓源细胞的融合以及药物处理的肿瘤细胞发生EMT后，其子代细胞表现一定的干细胞特性[54, 55]。全能诱导干细胞的发现也从另一方面证实干细胞特性可以通过细胞额外获取基因而获取。虽然大部分研究支持了EMT可以导致CSC含量增加，但目前没有研究直接证实不具备干细胞特性的普通肿瘤细胞通过EMT获取干细胞特性，也没有实验证明原有CSC是否通过EMT参与肿瘤转移。

 

缺氧诱导因子-1a（hypoxia inducible factor-1a，HIF-1a）

缺氧微环境在人类恶性肿瘤的发生发展过程中是普遍存在的，最近的研究表明其作为独立的危险因素与肿瘤的预后及耐药相关的转移相关[57-60]。肿瘤内部的缺氧微环境有利于高度恶性及高侵袭能力的肿瘤细胞的筛选，即有助于肿瘤的恶性进展[61-64]。

HIF-1是在缺氧的微环境中起重要作用的转录调控因子，很多体外实验都是以它为目标进行研究的。它由HIF-1α和HIF-1β组成[65]，其中HIF-1α是氧浓度依赖调控的，HIF-1β为持续表达的蛋白。在正常氧分压的环境中，HIF-1b稳定存在，而HIF-1a被快速的降解，只有在缺氧的环境中，HIF-1a可以不被降解而在胞浆中聚积，而后入核发挥作用。在缺氧的条件下培养的细胞，HIF-1α mRNA水平不变，蛋白表达水平升高[66, 67]，从而介导缺氧的信息给其他相关的蛋白[68,69]。 HIF-2α和HIF-3α同样属于HIF家族，其中HIF-2α在结构和功能上与HIF-1α类似，而HIF-3α由于缺少一个缺氧诱导域，所以在功能上和前两者存在区别。HIF-1α的研究最为透彻，在很多有关缺氧的研究中，它被作为主要的调控因子来研究，且被证实在很多的生理及病理过程中起重要作用。研究发现EMT的发生与HIF-1α和Snail的高表达密切相关，Snail的高表达是公认的可以诱导EMT发生的因素。缺氧或者HIF-1a的高表达来促进肿瘤细胞发生EMT转化的机制是多种多样的，但是它们都有一个共同的特征，就是都通过各种通路来抑制E-cadherin的表达，使细胞间的粘附减弱，进而有利于肿瘤细胞的远处转移。HIF-1α同样可以通过其他的信号通路来诱导上皮来源的细胞发生EMT转化，如直接或间接的调控Vimentin，Fibronectin等[70]。除此之外HIF-1α还具有调节血管生成的作用，它可以直接调控血管内皮生长因子（VEGF），从而诱导血管生成，因此HIF-1α的激活剂可以用在治疗缺血性疾病，而HIF-1α的抑制剂可以抑制肿瘤血管的生成，从而抑制肿瘤的转移。

 

本研究的设计思路

尽管EMT和CSC是目前肿瘤进展机制领域的两个重要主题，但二者之间的生物学关联却并不清楚。最新的资料表明[71,72]，EMT现象的发生与CSC的出现关系极为密切，据此我们推测：CSC很可能是肿瘤完成EMT程序的主要细胞载体。依据我们的前期研究结果[73, 74]，HIF-1α能够诱导人前列腺癌（PCa）细胞发生EMT现象，因此本研究拟通过从PCa细胞株中分选CSCs，鉴定其干细胞特征后转染HIF-1α，对比观察：HIF-1α对CSC和普通肿瘤细胞的EMT差异诱导效应，明确PCa中EMT现象的细胞载体究竟是否为CSC，进而为从细胞载体水平遏制肿瘤EMT进程开辟新思路提供理论依据。

 

二、研究对象与方法(略)

 

 三、研究结果

 

1.      SP法分选结果

经SP法分选细胞，结果发现在LNCaP中的SP细胞含量为0.8±0.1%。（图1）

 

2.      SP细胞的克隆性生长能力分析：平板克隆形成实验

LNCaP中所分选的SP细胞主要以连接紧密的克隆方式生长，具有典型的干细胞克隆性生长特征。而NSP细胞主要以松散分散的方式生长。（图2）

       进一步分析发现，LNCaP源的SP细胞的克隆形成能力（CFE）是NSP细胞的6.5倍：47.2±8.6% vs 7.3±5.9%（p<0.01）。（图3）

 

 

3.      LNCaP/SP细胞的干细胞标记物表达鉴定

应用免疫组织化学法检测干细胞标记物（ABCG2、α2、Nanog、CD44和OCT4等）在LNCaP/SP和LNCaP/NSP中的表达差异，结果发现（图4）：上述5种干细胞标记物在LNCaP/SP中呈典型的棕黄色阳性表达，而在LNCaP/NSP中呈阴性表达。

 

4.      体外侵袭能力和细胞增殖能力分析

Transwell试验表明（图5和表1）：在所观测的3个时间点上，LNCaP/SP细胞的穿膜细胞数均明显多于LNCaP/NSP细胞。另外，MTT试验表明（图6和表2）：LNCaP/SP细胞自第2天起快速增殖，曲线陡直；NSP细胞曲线较为平坦，第6天起快速增殖，至第7天时，LNCaP/SP的细胞数是LNCaP/NSP的3.7倍。另外，LNCaP/SP细胞的倍增时间出现在第2天，而LNCaP/NSP细胞的倍增时间出现在第7天。综合分析这些结果：LNCaP/SP细胞不但具有干细胞分子特征，而且还拥有强大的侵袭和增殖能力等干细胞行为特征。

 

 

5.  LNCaP/SP与LNCaP/NSP成瘤实验结果

LNCaP/SP与LNCaP/NSP实验组相比，成瘤的体积、成瘤率和转移率（肺转移+骨转移）均有显著差异（p<0.01）（图7、表3）。LNCaP/SP表现出干细胞行为特点，较LNCaP/NSP更为强大的致瘤和转移能力。

 

6.  HIF-1α对LNCaP/SP和LNCaP/NSP的EMT差异诱导结果

HIF-1α转染LNCaP/SP和LNCaP/NSP后，LNCaP/HIF-1α/SP和LNCaP/HIF-1α/NSP细胞阳性表达HIF-1α蛋白条带（图8），这证明了HIF-1α转染的有效性。进一步为验证HIF1α对LNCaP/SP和LNCaP/NSP的EMT诱导效应，应用Western印迹法检测这两种细胞在转染前后多种EMT分子标记物的表达状况，结果发现（图8）：⑴与LNCaP/SP相比，LNCaP/HIF-1α/SP发生了完

 

7．EMT转化对LNCaP/SP和LNCaP/NSP的体外侵袭和增殖能力的影响

应用Transwell侵袭试验和MTT试验，评价EMT属性变化对细胞体外侵袭和增殖能力所造成的生物学效应。Transwell（图5、表1）和MTT试验（图6、表2）的结果一致：EMT阳性细胞（LNCaP/HIF-1α/SP和LNCaP/HIF-1α/NSP）的体外侵袭和增殖能力显著强于EMT阴性细胞（LNCaP/SP和LNCaP/NSP）。尤其是LNCaP/SP经HIF-1α诱导EMT后，细胞体外侵袭和增殖能力的强化，较LNCaP/NSP更为典型。

 

8．动物实验

四种细胞以5´105数量级进行裸鼠皮下注射，每种细胞接种15只，连续观察12周。结果四组小鼠中均可成瘤（图9、表3）。LNCaP/SP与LNCaP/NSP实验组的比较见结果5。LNCaP/HIF-1α/SP与LNCaP/SP实验组相比，成瘤的体积、成瘤率和转移率（肺转移+骨转移）均有显著差异（p<0.01）。LNCaP/HIF-1α/NSP和LNCaP/NSP实验组相比，成瘤的体积和成瘤率有显著差异（p<0.01），但转移率均为0。与其他组相比，LNCaP/HIF-1α/SP组显示出最强的致瘤能力和转移能力（p值均<0.01）。

 

 

9. 瘤体EMT特性鉴定

瘤体切片的免疫组化染色显示（图10）：⑴与LNCaP/SP相比，LNCaP/HIF-1α/SP上皮属性蛋白E-cadherin表达缺失，而间质属性蛋白Vimentin、MMP-2、α-SMA、β-catenin反常表达；⑵与LNCaP/NSP相比，LNCaP/HIF-1α/NSP上皮属性蛋白E-cadherin表达缺失，而间质属性蛋白Vimentin和β-catenin反常表达。这些结果表明了在体内致瘤后，LNCaP/HIF-1α/SP所致瘤块保持了EMT阳性的分子学标志，LNCaP/HIF-1α/NSP所致瘤块保持了部分EMT阳性的分子学标志，而LNCaP/SP与LNCaP/NSP所致瘤块则保持了EMT阴性的属性。

 

四、讨论

 

肿瘤是全球范围内严重危害人类健康的重大疾病，发病率居高不下。探讨肿瘤的起源、复发、转移的机制对于肿瘤的预防和治疗都有着重要意义。近些年，CSCs 的研究倍受学术界的关注，因为这一理论提示我们，CSCs 可能是肿瘤的起源、复发、耐药和转移的罪魁祸首。

CSCs理论包含两个观点[75, 76]：①肿瘤起源于成体干细胞或者具有干细胞性质的祖细胞；②肿瘤组织中有一群类似干细胞的肿瘤细胞，它们推动肿瘤的生长并且是肿瘤复发和转移的“种子”。目前还没有证据证明前一观点，它只是停留在假说阶段。但是科学家们仍然找出诸多现象来支持他们的假说：首先，肿瘤细胞和干细胞有很多类似的生物学行为，如自我复制[24]，侵袭转移[77, 78]，诱导血管生成[79]，形态幼稚等。这些很容易让人们联系到，肿瘤细胞可能是发生能恶性转化的干细胞。其次，细胞的恶性转化是一个多阶段的过程。干细胞的生命周期相对较长，能够比分化成熟的细胞积累更多的转化所需的各种突变。再次，肿瘤细胞和干细胞有很多共同的信号转导通路，分别发挥着重要作用，如Notch[80-83], Wnt[84], Hedghog[85, 86], Pten[87, 88]，等等。因此，干细胞比分化成熟的细胞转化成肿瘤细胞所需的突变更少。另外，虽然引发细胞恶性转化的基因各不相同，但是它们所产生的肿瘤细胞却有着相似的生物学行为和分子基础。这也让人们很容易联系到，各种不同的突变可能是发生在同一种细胞上，而这种恶性突变的“载体细胞”很可能是干细胞。对于CSCs理论所涉及的第二个观点，目前已经有诸多证据给予支持。不仅仅是异种移植中成瘤能力的差异，随着研究的深入，人们发现在对抗放化疗损伤、基因表达模式和生物学行为等方面，CSCs都呈现出了不同的特性。其中一个重要的观点更是引起了癌症研究领域的极大重视：肿瘤在发生转移的时候出现了上皮间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）的同时，呈现出了CSCs的诸多特性并表达CSCs特有的表面标志[53]。这一发现，有力地证明了CSCs与肿瘤转移密切相关。

免疫表型法和SP法是目前学术界最常用的两种CSCs分选技术。其中，免疫表型法已成功运用于恶性神经胶质瘤、膀胱癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌及结肠癌等多种实体肿瘤的CSCs分选[89-94]。2005年，Collins[33]用此法从原位前列腺癌组织中成功分选出CSCs，并确认其免疫表型为CD133+/α2β1high/CD44+。此后，Patrawala[95]报道在前列腺癌异种成瘤组织中存在的CD44+细胞也具有典型的干细胞特征，而且80%的CD44+细胞同时CD133+/α2β1high/CD44+。Hurt[96]从前列腺癌LNCaP细胞株中分选出的CD44+CD24−细胞也被认为具有CSC特征，巧合的是，这群细胞往往同时阳性表达CD133，随着培养环境中血清浓度的增加，整合素α2的表达丰度随之增高。这些结果一方面说明了免疫表型法在CSC分选工作中的有效性，另一方面也提示我们：PCa中CSC的免疫表型缺乏一致性，而且可能随着环境改变而发生变化。根据Tang的研究分析[97]：CSC内部也存在等级结构，CD44+细胞是一种比CD133+/α2β1high/CD44+细胞更为原始的CSC。在我们的前期研究中，应用流式分选技术检测了5种PCa细胞株中CD44和CD133双阳性表达的细胞含量，结果表明，CD44和CD133双阳性细胞在Du145、IA8、LNCaP 、TSU-PrL和PC-3中的含量分别为：0.01%，0，0.01%，0和0.02%，丰度极低，几乎难以检测。分析认为，研究中所用5种PCa细胞株均由前列腺癌体内不同转移病灶中分离建系，正是由于细胞株建系前所生存的微环境不同，导致CSC表型发生了变化，因此，原位PCa组织中所确认的免疫表型并不适合体外细胞株中CSC分选。

       1996年Goodell发现[98]：肿瘤内部存在一群膜表达ABCG2转运蛋白的细胞，这些细胞不仅能够将荧光染料Hoechst33342泵出胞浆，而且内部富含干细胞样肿瘤细胞，根据细胞对Hoechst33342的外排特性，用流式细胞仪将其分选出来，这种技术就是SP分选法。此后有学者应用此法，从急性髓性白血病、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、肺癌和甲状腺癌等多种肿瘤中分选出CSC[99]。目前SP 细胞分选方法作为富集CSC的方法之一，得到了较为广泛的认可和应用。尤其是在某些尚未发现CSC特异性的表面标志的肿瘤组织和细胞系中，SP 细胞的分选表现出了更大的优势，提供了更为简洁而且可靠的CSC的富集办法，让科学家们从寻找CSC标志的苦恼中得以解脱。

本研究尝试用SP法分选，结果从PCa细胞株LNCaP中分选出了具有干细胞行为特征和分子学特征的SP细胞，比率为0.8±0.1%。考虑到CSC免疫表型的易变性，SP法在今后从细胞株分选CSC的工作中更为实用。在研究过程中我们发现，分选后的SP细胞的比例是接近99%的，但是在分选后的第48小时就变为20%（本文数据没有显示），说明SP细胞在分选后发生了分化。然而，正常培养的两株细胞系中，在稳定状态下，SP细胞的比例是基本稳定的，不会像分选出的SP细胞那样随着时间而比例减少。这一现象提示我们，未分选的SP细胞，在SP细胞和NSP细胞共同建立的稳定环境中可能是不发生分化的。也就是说，微环境使SP细胞维持了它的多能性和自身的数量。一旦NSP细胞数量减少或者SP与NSP细胞分离，微环境中的平衡被打破，SP细胞就分化出更多的NSP细胞，力图构建新的平衡。所以，NSP细胞与SP细胞共同构建的微环境可能是维持SP细胞的多能性和抑制其分化的重要因素之一。虽然尚缺乏确凿的实验证据，但是科学家们普遍认为，干细胞的分化是通过细胞分裂来实现的。也就是说，从保持着多能性的干细胞到具有特定功能的成熟的体细胞的分化过程，一定伴随着干细胞从静止状态进入细胞周期，最后分裂增殖。

如今越来越多的证据表明，EMT和CSC这两个肿瘤进展过程中的重要现象之间存在极为密切的生物学关联。比如：miR-200 和let-7是两个序列高度保守的家族，它们不仅可以直接与ZEB1和ZEB2编码基因启动子区的E-盒结合[100, 101]，达到遏制细胞EMT转化的效应，而且可以调节BMI1的表达，使细胞获得干细胞样的自我更新能力[102, 103]。另外，在肿瘤边缘具有强大侵袭能力的细胞群里发现，高表达的β-catenin不仅调节细胞EMT相关的转移侵袭蛋白，而且还能够影响细胞中某些干细胞分子标记物（hTert和survivin）的表达[104]。当然，其他一些研究资料也提示，完成EMT转化的瘤体中通常有丰富的CSC存在[53-55]。

HIF-1是一个重要的转录因子，在缺氧的环境中被激活，参与细胞增殖侵袭及血管生成。它是一个异质二聚体，包括HIF-1a和HIF-1b。在正常氧分压的环境中，HIF-1b稳定存在，而HIF-1a被快速的降解，只有在缺氧的环境中，HIF-1a可以不被降解而在胞浆中聚积，而后入核发挥作用。Thomas等[105]报道无血清培养是在正常氧分压的条件下HIF-1a的潜在的诱导因素，这种现象在前列腺癌细胞PC3和LNCaP中都存在，伴随着细胞生存能力的增强和HIF-1a下游基因的激活，如血管内皮生长因子（VEGF）和胰岛素样生长因子2（IGF-2）。HIF-1a诱导肿瘤细胞发生EMT现象在前列腺癌和结肠癌中均有报道。在肿瘤细胞的无限制生长的过程中，不可避免的出现营养缺乏，而这又可以导致HIF-1a的激活，进而细胞的生存能力及侵袭能力增强，从而发生远处转移，所以我们可以理解，肿瘤的微环境对于肿瘤的远处转移有极其重要作用，就像缺氧微环境可以导致HIF-1a高表达，导致EMT发生，促进肿瘤细胞的转移。除此之外，Cannito等[106]报道缺氧的条件下肿瘤细胞发生EMT转化是通过抑制葡萄糖合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3, GSK3），进而Snail入核来完成的，而肿瘤细胞的远处转移是通过持续表达的HIF-1a和VEGF来实现的。与此不同的是，Yang等[107]报道缺氧或者HIF-1a的高表达是通过直接调控Twist来实现EMT转化的，在缺氧的条件下干扰HIF-1a的表达，Twist的表达亦会降低，进而观察到EMT现象的逆转，即MET转化。进一步的研究证实BMI1和Twist具有协同作用，通过促进肿瘤细胞发生EMT转化导致肿瘤细胞转移[108]。Mak等[109]的研究证实，雌激素受体（estrogen receptor beta，ERβ）可以通过破坏HIF-1a的稳定性及抑制VEGF介导的Snail入核来阻止前列腺癌细胞发生EMT的转化，这种作用在Gleason评分高的前列腺癌患者中尤为明显。这也为我们的临床治疗指明了一条可行的道路。缺氧或者HIF-1a的高表达来促进肿瘤细胞发生EMT转化的机制是多种多样的，但是它们都有一个共同的特征，就是都通过各种通路来抑制E-cadherin的表达，使细胞间的粘附减弱，进而有利于肿瘤细胞的远处转移。与此相反的研究证实[110]，高氧处理的小鼠的腺癌细胞可以发生MET的转化，这就提示我们氧分压的不同可以导致肿瘤细胞在EMT和MET之间相互转化，当肿瘤细胞通过EMT转化脱离了缺氧的微环境后，转移到新的部位，可能开始血液供应充分，氧气充足，发生了相反的变化，即MET的转化，这样E-cadherin的再次表达可以使细胞间的粘附能力增强，从而有利于转移灶的形成。我们进行的前期研究结果[73, 74]提示，HIF-1α能够诱导人前列腺癌细胞（PCa）发生EMT现象。

本研究正是在这样的背景下深入探讨EMT和CSC的相互关系。通过实验我们发现：在HIF-1α的诱导下，LNCaP/SP发生了非常典型的完全EMT属性的分子学变化和行为学变化。具体说：⑴与LNCaP/SP相比，LNCaP/HIF-1α/SP发生了完全EMT转化，包括2种上皮属性蛋白E-cadherin和CK18表达缺失，而间质属性蛋白Vimentin、N-cadherin、Fibronectin、Cathepsin D、MMP-2、uPAR反常表达；⑵与LNCaP/NSP相比，LNCaP/HIF-1α/NSP发生了部分EMT转化，包括2种上皮属性蛋白E-cadherin和CK18表达缺失，而间质属性蛋白Vimentin和Cathepsin D反常表达；（3）EMT阳性细胞（LNCaP/HIF-1α/SP和LNCaP/HIF-1α/NSP）的体外侵袭和增殖能力显著强于EMT阴性细胞（LNCaP/SP和LNCaP/NSP）。这说明，CSC确实是瘤体EMT现象发生的主要细胞载体。究其原因，我们认为：EMT是一个涉及到3000多个基因突变的庞大工程，其中关键的启动基因近100多个，要完成EMT转化，需要满足两个因素：一，时间因素，即细胞应该具备积累复杂基因突变所需的足够生存周期；二，空间因素，这些突变基因应该集中于某一个或某一群细胞，突变基因在细胞中的分散将造成EMT进程中断。考虑到这两个条件，CSC作为EMT发生的天然理想细胞载体的优势则凸显出来：CSC不仅具有无限增殖和自我更新能力，这种优势使其比普通肿瘤细胞生存周期更长，基因传递更稳定，而且CSC能够通过不对称分裂将基因表型完整稳定的传递给子代CSC，这使CSC能够完整的积累EMT相关基因改变。综上所述，CSC作为EMT细胞载体的研究结果，将有助于开辟EMT阻断工作的新思路，避免了EMT信号通路阻断的诸多干扰因素，破坏或清除CSC极有可能提高肿瘤EMT阻断措施的有效性。

此外，本研究还发现了一项重要的意外结果：LNCaP/NSP经HIF-1α转染后，不仅获得了干细胞分子特征（ABCG2），而且也出现了部分EMT转化的分子学变化和行为学变化；从LNCaP/HIF-1α/NSP中二次分选SP的效率达到了1.1%（本文未展示相关结果）。这说明，LNCaP/HIF-1α/NSP中极有可能出现了新的干细胞亚群，而且这部分干细胞很可能成为完成部分EMT程序的主体细胞。尽管对这个现象的具体机制尚不清楚，但可以参考缺氧Niche对肿瘤细胞的作用机制。最近的研究证实[111]，缺氧Niche可以增强胶质母细胞瘤中普通肿瘤细胞形成克隆球的能力，也能够促使其获得重要的干细胞分子标记物，如Nanog、OCT4和c-myc；此外，缺氧Niche有助于CSC池扩容，为肿瘤转移播散提供必要的条件[112]；如果敲除HIF基因后，缺氧Niche的这些生物学效应将被有效遏制[113]。当然，HIF-1α也可能直接促使普通肿瘤细胞向具有干细胞特征的原始状态细胞去分化，继而这些干细胞样细胞将进一步完成EMT相关的基因突变和积累[114, 115]。

本研究动物实验中，分别以103、104、105数量级的四组细胞对每组动物行皮下注射，连续观察12周。结果103、104数量级细胞均未致瘤，只有105数量级的细胞注射后在四组小鼠中成瘤。Chiba等[41]在研究肝癌细胞系Huh7和PLC/PRF/5中报道，SP细胞只需要1 × 103就可以在小鼠体内成瘤，而NSP细胞却需要超过1 × 106。SP 细胞在连续移植实验中都可以形成肿瘤，并且可以产生SP和NSP两种细胞。本研究利用SP细胞作为研究对象，由于在分选前准备过程中染料对细胞具有毒性，抚育时间较长，对细胞打击较大，因此分选后细胞数量虽然符合要求，但细胞功能状态很难保证，这可能也是SP细胞动物成瘤实验需要的细胞数量较其他报道多的重要原因。本研究在致瘤的105数量级细胞实验组中可以看出：SP细胞的致瘤能力和转移能力强于相同条件下的NSP细胞；过表达HIF-1α的细胞的致瘤能力和转移能力强于相同条件下的HIF-1α阴性细胞。这也证明了肿瘤干细胞的致瘤能力和转移能力强于相同条件下的普通肿瘤细胞，发生EMT的肿瘤细胞的致瘤能力和转移能力强于相同条件下的非EMT肿瘤细胞；而发生EMT的肿瘤干细胞（LNCaP/HIF-1α/SP）的致瘤能力和转移能力均最强。最后通过对瘤块进行免疫组化染色，证明了小鼠体内成瘤的细胞保持了与体外培养时一致的EMT属性。

五、小结

 

1. 在HIF-1α的诱导下，LNCaP/SP发生了非常典型的完全EMT属性的分子学变化和行为学变化，这说明，与普通肿瘤细胞相比，肿瘤干细胞更易发生EMT转化现象，肿瘤干细胞确实是前列腺癌EMT现象发生的主要细胞载体。

2. 运用SP法分选，可从PCa细胞株LNCaP中分选出SP细胞，具有干细胞行为特征和分子学特征。SP细胞可以认为是干细胞富集群体，可以作为进一步肿瘤干细胞研究的对象。