妊娠奶牛奶对雄性幼鼠内分泌代谢及青春期发育的影响

该文章已经刊登在《毒理学杂志》2009, 23(5): 395-397.

马亚萍1，徐庄剑1，胡瑜2，李莉华3，赵建伟2，吴玉玉4，金琳芳4，王勍1，林士霞1，庞兴甫1，张文杰1 江南大学附属医院儿科徐庄剑

（1.苏州大学第四临床医学院 儿科 江苏 无锡 214062；2.检验科；3.中心实验室；4.病理科）

关键词：  妊娠奶牛奶；雄性幼鼠；雌二醇；孕酮；睾酮；青春期

牛奶是人们重要食品之一，营养丰富，但现代消费的牛奶雌性激素含量增加。牛奶中的雌性激素是环境雌激素的一种，其消费与成人某些激素相关性肿瘤的发生有一定相关性[1-3]。妊娠奶牛奶是现代市售纯牛奶中雌性激素水平增高的重要原因之一[4]。妊娠奶牛奶或以妊娠奶牛奶为主的现代市售纯牛奶中雌性激素对儿童生长发育的影响及其相关动物实验报道甚少，对雄性幼鼠的生长发育及代谢等研究报道亦甚少。本研究旨在探讨妊娠奶牛奶中雌性激素对雄性幼鼠内分泌代谢及青春发育的影响，为进一步开展对其儿科临床和流行病学研究等提供动物实验依据。

1  材料与方法

1.1  实验材料

1.1.1  实验用奶及其储存：(1)产后28～35 d奶牛奶混匀；(2)妊娠210～230 d奶牛奶混匀；(3) 同一品牌市售纯牛奶拆装混匀；(4)自配实验配方奶(详见1.2.2)。

1.1.2  动物：48只19日龄清洁级雄性Sprague-Dawley幼鼠，由浙江省实验动物中心提供(合格证号：SCXK(浙)20030001)。

1.1.3  主要试剂和仪器：硫酸酯酶(美国，SIGMA公司)、谷朊粉和椰子油。ACCESS全自动微粒子免疫化学发光分析仪及配套试剂(美国，BECKMAN公司)，LUNAR PRODIGY ADVANCE双能X线骨密度仪(德国，GE公司)。

1.2  方法

1.2.1  牛奶中蛋白质、脂肪和乳糖含量的测定：分别采用凯氏定氮法、哥特里－罗兹法和还原糖直接滴定法检测牛奶中蛋白质、脂肪和乳糖的含量。

1.2.2  实验配方奶配制与奶液能量平衡：根据上述测定结果，将产后奶牛奶、妊娠奶牛奶和现代市售纯牛奶中蛋白质、脂肪和乳糖最高者做为配制实验配方奶的配制标准，其蛋白质、脂肪和乳糖分别用谷朊粉、椰子油和碳水化合物替代；并添加维生素和微量元素[5]。同时将上述三种牛奶中添加蛋白质、脂肪和乳糖使4组的相应成分含量相同。

1.2. 3  乳清总雌二醇(total estradiol，TE2)和孕酮(progesterone，P4)的测定：采用免疫化学发光法检测乳清TE2 和P4。乳清中的E2有游离型和结合型两种形式，结合型主要与硫酸根离子结合，因此需先用硫酸酯酶水解法将结合型E2转变为游离型E2，再检测样本中TE2含量[6]。具体方法：取样品2ml，离心(14 000转/分)90 min，抽乳清0.45ml，加入0.5ml乙酸钠缓冲液后，再加入0.05ml硫酸酯酶溶液(含25U硫酸酯酶)，在37℃水浴下孵育21 h，检测上述混合液(乙酸钠为100mmol/L，氯化钠为0.02%)中的E2，TE2=所测浓度÷0.45。检测乳清P4的标本不经过硫酸酯酶水解。

1.2.4  动物实验步骤 

1.2.4.1 动物分组和喂养：48只21日龄清洁级SD雄性幼鼠按体重采用随机数字表法等分入产后奶牛奶、妊娠奶牛奶、现代市售纯牛奶和实验配方奶4组，室温(20±2)℃，一鼠一笼，由专人用特制负压瓶定量喂奶。开始7 d给予每只10ml/d，随后10 d给予20ml/d，最后15 d给予30ml/d，在规定的奶量完成后自由取食鼠饲料和水。观察龟头外翻日龄、体重和尾长，53日龄时处死，加测身长。

1.2.4.2  尿的收集和检测：4组幼鼠于第33~35日龄(龟头外翻前)、48~50日龄(龟头外翻后)2个时段收集尿，每个时段随机将幼鼠分3批于3日收集24h尿并记量，留5ml置–80℃储存备测雌三醇(estriol，E3)、P4、睾酮(testosterone，T)、卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)和黄体生成素(luteinizing hormone，LH)，并检测肌酐(creatinine，Cr)。

1.2.4.3  幼鼠处死时的取材及检测  麻醉状态下测量体重、身长和尾长。心脏抽血后离心取血清，–80℃储存备测P4和T。分离睾丸、附睾、精囊和腹侧前列腺，用分析天平(精确读数至0.001g)称量湿重。分离左胫骨–20℃储存备测骨密度。具体方法为：常温解冻后(保持胫骨生理盐水湿润状态)检测骨密度，专人操作，连测3次，取其均值，并计算骨密度校正指数(骨密度/体重[7])。

1.2.5  统计学方法  采用SPSS13.0统计软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差 表示。各组实验数据均进行正态性检验(Kolmogorov-Smirnov法)和方差齐性检验(Levene法)，若符合正态分布和方差齐性，4组间均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，均数间两两比较采用多个样本均数间的两两比较(Student-Newman-Keuls检验)；若不符合正态分布或方差不齐，4组间均数比较采用Kruskal-Wallis H检验，多个样本均数间两两比较采用Nemenyi法检验。P<0.05表示差别有统计学意义。

2  结果

2.1  乳清中TE2 和P4  产后奶牛奶、妊娠奶牛奶、现代市售纯牛奶和实验配方奶中的TE2分别为160.22、324.07、227.18 和78.04 pg/ml；P4分别为0.89、3.07、3.20和0.29 ng/ml。

2.2  龟头外翻日龄  产后奶牛奶、妊娠奶牛奶、现代市售纯牛奶和实验配方奶组龟头外翻日龄分别为(40.58±1.51)、(40.67±1.67)、(41.17±1.34)和(39.58±1.31) d，差别无统计学意义(F=2.466，P=0.075)。

2.3  尿中激素  龟头外翻前(青春期启动前)和龟头外翻后(青春期启动后)的尿P4/Cr、LH/Cr、FSH/Cr、FE3/Cr和T/Cr差别均无统计学意义。  

2.4  骨密度  上述4组左胫骨骨密度分别为(0.15±0.02)、(0.15±0.02)、(0.16±0.02)和(0.16±0.03) g/cm2及校正骨密度分别为(0.53±0.11)×10-3、(0.53±0.08)×10-3、(0.55±0.09)×10-3和(0.53±0.10)×10-3 cm-2，差别均无统计学意义(前者F=1.046，P=0.382；后者F=0.196，P=0.898)。

2.5  体重、尾长和身长  上述4组的动态体重和尾长差别均无统计学意义；其身长分别为(20.30±0.94)、(20.26±0.56)、(20.01±0.90)和(20.54±0.55) cm，差别亦无统计学意义(H=2.582，P=0.461)。

2.6  血清P4和T  上述4组血清P4分别为(19.02±5.51)、(18.26±5.94)、(17.87±6.57) 和(20.02±7.86) ng/ml，差别均无统计学意义(F＝0.253，P＝0.859)；血清T分别为(7.14±6.48)、(3.34±2.84)、(2.35±1.44)和(3.23±2.99) ng/ml，其中产后奶牛奶组的血清T高于现代市售纯牛奶组(χ2产后奶牛奶组，现代市售纯牛奶组=9.330, P<0.05)，其余各组间差别均无统计学意义。

2.7  生殖器官脏器指数  4组睾丸、附睾和腹侧前列腺脏器指数差别均无统计学意义。妊娠奶牛奶组的精囊腺脏器指数(1.80±0.40) mg/g 高于产后奶牛奶组(1.44±0.33) mg/g (P<0.05)，其余各组间差别均无统计学意义。

3  讨论

人们消费的现代市售纯牛奶的雌性激素含量较其100年前传统牛奶明显增高。其原因除饲养方法[2]和奶牛品种[8]不同外，主要与妊娠奶牛奶有关。奶牛几乎在整个怀孕期间持续泌乳以增加产量，尤其是妊娠后期，牛奶中的雌性激素也因此增加[4]。本课题组前期对我国6个品牌现代市售纯牛奶中的游离E2和P4进行检测，显示4/6品牌的雌性激素含量较高，2/6品牌的含量与传统牛奶接近，最高的E2是最低的4.8倍，最高的P4是最低的2.5倍[9]。牛奶中的雌性激素包括雌激素(包括雌酮、E2和E3 3种)和P4。Ganmaa 等[6]检测牛奶中雌酮（其结合型占90%）占所有雌激素的69％，雌酮、TE2和TE3 占雌激素比例分别约为7:2:1，妊娠第220~240天硫酸雌酮浓度为1 000 pg/ml，大约75％的市售牛奶来源于妊娠奶牛。在本研究中，产后奶牛奶、妊娠奶牛奶和现代市售纯牛奶乳清TE2浓度分别为160.22、324.07和227.18 pg/ml，按总雌酮、TE2和TE3比例推算，上述三种乳清中硫酸雌酮浓度约分别达561、1 020和715 pg/ml，后两者均明显高于前者，并与Ganmaa等[6]报道的妊娠奶牛奶水平基本吻合或接近；妊娠奶牛奶和现代市售纯牛奶P4浓度接近，分别为3.07和3.20 ng/ml，均在Chenault等[10]报道的妊娠奶脱脂奶浓度范围(妊娠193~220 d时P4的浓度为2.5~6.5 ng/ml)之内，且二者均高于产后奶牛奶(P4浓度为0.89 ng/ml)2倍以上。可见本研究所用的现代市售纯牛奶相当部分来源于妊娠奶牛奶。

现代市售纯牛奶与人类健康的研究仅见流行病学方面的文献，有关动物研究也较少，且有分歧。Ganmaa等[6]的研究未发现现代牛奶对大鼠亲代和子代生殖功能有明显影响，但子代中有1例出生时即死亡，3例有骨骼异常。李湘鸣等[8,11]的研究亦未发现牛奶中雌激素样物质对雄、雌大鼠生殖腺重量有明显影响。本研究显示现代市售纯牛奶与实验配方奶组生殖器官脏器指数无差异，与Ganmaa和李湘鸣[6,8]的研究结果相符；但本研究妊娠奶牛奶组的精囊腺脏器指数高于产后奶牛奶组，此现象尚未见文献报道，其机理不清，有待进一步研究。

在本课题组前期研究中，现代市售纯牛奶喂养雌性SD幼鼠(每天每只20mL，10 d)后24h尿雌三醇和P4排泄增多[12]，且妊娠奶牛奶24h尿雌三醇和P4排泄也有增多现象[13]，而本研究显示妊娠奶牛奶喂养雄性幼鼠(每天每只10mL，7 d；随后每天每只20mL，6 d)后青春期启动前P4/Cr、LH/Cr、FSH/Cr、FE3/Cr和T/Cr影响均无统计学意义，其差异可能与干预时间及摄入的奶液量不同等有关。

本研究现代市售纯牛奶组和妊娠奶牛奶组的幼鼠血清T分别为(2.35±1.44)和(3.34±2.84) ng/ml，二者均低于产后奶牛奶组(7.14±6.48) ng/ml，其现代市售纯牛奶组与产后奶牛奶组差异有统计学意义，但雌性激素含量较现代市售纯牛奶高的妊娠奶牛奶组与产后奶牛奶组差异却无统计学意义，此现象是否与血清T数据离散度较大有关，有待扩大样本进一步研究。有较高雌性激素含量的牛奶组较产后奶牛奶组血清T低的现象似乎符合外周性激素对下丘脑-垂体-性腺轴的负反馈机制。

本研究所用妊娠奶牛奶和现代市售纯牛奶对雄性幼鼠体格生长、龟头外翻日龄、生殖器官脏器指数(精囊腺除外)、骨密度、血清P4、尿P4、尿LH、尿FSH、尿FE3和尿T浓度差别均无统计学意义，但妊娠奶牛奶组的精囊腺脏器指数高于产后奶牛奶组，现代市售纯牛奶组幼鼠血清T低于产后奶牛奶组。妊娠奶牛奶成分复杂，除含有雌性激素外，还可能含有类雌性激素样物质和促进雌性激素分泌的物质，也可能含有拮抗雌性激素或抑制其分泌的物质。因此，妊娠奶牛奶或以妊娠奶牛奶为主的市售纯牛奶中雌性激素对雄性幼鼠内分泌代谢及青春期发育的影响及其机理复杂，有待进一步或寻找更敏感的观察指标和更先进的研究手段深入研究。

参考文献：

[1]       Ganmaa D, Sato A. The possible role of female sex hormones in milk from pregnant cows in the development of breast, ovarian and corpus uteri cancers. Med Hypotheses, 2005, 65: 1028-1037.

[2]       Qin LQ, Wang PY, Kaneko T, et al. Estrogen: one of the risk factors in milk for prostate cancer. Med Hypotheses, 2004, 62: 133-142.

[3]       Chan JM, Stampfer MJ, Ma J, et al. Dairy products, calcium, and prostate cancer risk in the Physicians' Health Study. Am J Clin Nutr, 2001, 74: 549-554.

[4]       Ganmaa D, Wang PY, Qin LQ, et al. Is milk responsible for male reproductive disorders? Med Hypotheses, 2001, 57: 510-514.

[5]       胡亚美, 江载芳. 诸福棠实用儿科学[M]. 第7版. 北京: 人民卫生出版. 2002, 113.

[6]     Ganmaa D, Qin LQ, Wang PY, et al. A two-generation reproduction study to assess the effects of cows' milk on reproductive development in male and female rats. Fertil Steril, 2004, 82: 1106-1114.

[7]       姜向坤. 补肾复方对去势雌性大鼠骨影响的实验研究. 成都中医药大学2001级博士学位论文. 2004.

[8]       李湘鸣, 刘秀梵. 牛奶中雌性激素样物质对雄性大鼠生殖腺的影响. 卫生毒理学杂志, 2003, 17: 97-100.

[9]       袁丽君, 徐庄剑, 胡瑜, 等. 部分牛奶中的雌二醇和孕酮的含量分析. 中国食品卫生杂志, 2007, 19: 139-141.

[10]    Chenault JR, Hornish RE, Anderson YC, et al. Concentrations of progesterone in milk of cows administered an intravaginal progesterone insert. J Dairy Sci, 2003, 86: 2050-2060.

[11]    李湘鸣, 秦立强, 王培玉, 等. 牛奶中雌激素样物质对大鼠卵巢和子宫的影响. 卫生毒理学杂志, 2003, 17: 217-219.

[12]    袁丽君, 徐庄剑, 胡瑜, 等. 牛奶中雌性激素样物质对雌性幼鼠尿雌三醇和孕酮的影响. 现代预防医学, 2007, 34: 4498-4501.

[13]  袁丽君, 徐庄剑, 赵建伟, 等. 妊娠奶牛奶对雌性幼鼠尿雌三醇和孕酮影响. 中国公共卫生, 2007, 23: 1225-1227.

基金项目：第五批（2007年度）苏州大学医学发展基金项目(21)

作者简介：马亚萍，硕士在读，研究方向：小儿内分泌

通讯作者：徐庄剑，教授，硕士生导师，研究方向：小儿内分泌