串联质谱技术在脂肪酸氧化代谢病诊断中的应用研究

  中华医学遗传学杂志，2007，24(6)：692-695

韩连书  叶军  邱文娟  高晓岚  王瑜  张拥军  顾学范

摘要  目的  本研究探讨利用串联质谱技术检测干血滤纸片中酰基肉碱水平，诊断脂肪酸氧化代谢病。方法 对象为2941例临床遗传性代谢病高危儿童,利用串联质谱技术检测患儿干血滤纸片中酰基肉碱水平，结合临床资料和常规生化结果，进行脂肪酸氧化代谢病诊断。结果  诊断14例脂肪酸氧化代谢病(0.5%)。其中肉碱棕榈酰转移酶I缺乏症1例，肉碱棕榈酰转移酶II缺乏症1例，短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症1例，中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症7例，极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症2例，多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏症2例。结论  通过串联质谱技术检测干血滤纸片中酰基肉碱水平，可对部分脂肪酸氧化代谢病的进行诊断。上海新华医院儿童内分泌遗传科韩连书

[关键词] 串联质谱；脂肪酸氧化代谢病；酰基肉碱；遗传性代谢病

Effective of tandem mass spectrometry on the diagnosis of fatty acid oxidation disorders  HAN Lian-shu, YE Jun, QIU Wen-juan, GAO Xiao-lan, WANG Yu, ZHANG Yongjun, GU Xue-fan. (Department of Pediatric Endocrinology and Genetic Metabolism, Shanghai Institute for Pediatric Research, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medical, Shanghai 200092, China)

Corresponding auther: GU Xue-fan, E-mail: guxuefan@citiz.net

[Abstract]  Objective  The aim of the present study was to screen and diagnosis FAOD in high risk children with inborn error of metabolism using tandem mass spectrometry. Method  The study group consisted of 2941 high risk cases of suspected inborn error of metabolism were tested. The acylcanitines in the dry blood filter papers of patients were tested by tandem mass spectrometry. The diagnosis of FAOD were according to the levels of the acylcanitines, the clinical symptoms, and other biochemistry study. Results  Fourteen patients were diagnosed as FAOD. These patients included one carnitine palmitoyltransferase deficiency I, one carnitine palmitoyltransferase deficiency II, one short-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency, seven medium-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency, two very long-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency, and two multiple acyl-CoA dehydrogenase deficiency. Conclusion  FAOD are not rare in China. Analiysis acylcarnitines levels tested by tandem mass spectrometry are helpful to diagnose FAOD.

[Key words]  tandem mass spectrometry; fatty acid oxidation disorders; acylcarnitine; inborn error of metabolism

脂肪酸氧化代谢病是指脂肪酸进入线粒体途径或脂肪酸在b氧化过程中，由于所需酶的功能障碍导致脂肪酸氧化受阻所导致的一组疾病[1]。由于这些疾病缺乏特异的临床表现和常规实验室检查方法，诊断比较困难。近几年开展的串联质谱技术，一次实验可测定血中30余种酰基肉碱，可辅助10余种脂肪酸氧化代谢病的筛查和诊断[2]。我们于2002年11月在国内率先开展串联质谱新技术进行遗传性代谢病的筛查和诊断[3]，至今已筛查出14例脂肪酸氧化代谢病患儿，分析如下。

1   对象与方法

1.1  对象

疑似遗传性代谢病患儿2941例，其中男1882例，女1059例，年龄中位数为1岁(1天～18岁)。临床表现包括智力、运动发育落后，反复呕吐、抽搐，生长发育迟缓、嗜睡或昏迷。体检发现肝脾肿大和肌张力异常等，常规实验室检查提示代谢性酸中毒、低血糖、高血氨、高乳酸血症、肌酸肌酶增高等。标本采集用干血滤纸片法。

1.2 材料与方法

1.2.1  试剂：酰基肉碱同位素内标混合试剂（含8种同位素内标）、甲醇、盐酸正丁醇、乙腈和氮气。

1.2.2  方法：样品处理：参考文献[3]报道的方法，取直径3mm的干滤纸血片，经甲醇萃取，盐酸正丁醇衍生，进行串联质谱检测。

1.3   脂肪酸氧化代谢病的诊断

串联质谱检测的干血滤纸片中23种酰基肉碱水平正常上、下限值取1480例健康儿童的第99.8和0.002百分位，参考美国CDC报告的参考值及文献报道进行设定。不同的脂肪酸氧化代谢病的诊断，依据脂肪酸氧化代谢病的发病机制，以及国外有关串联质谱进行脂肪酸氧化代谢病诊断标准的报道[4]，分析分析串联质谱特异性酰基肉碱谱，结合临床表现和常规实验室检查，除外其他可能引起酰基肉碱异常的疾病进行确诊。

2  结果

2.1  串联质谱检测结果

在2941例患儿中诊断脂肪酸氧化代谢病14例（0.5％），串联质谱检测结果见表1。肉碱棕榈酰转移酶I缺乏症（Carnitine Palmitoyltransferase Deficiency，CPT-I）主要表现为游离肉碱（Free carnitine，C0）及C0/乙酰肉碱（Actylcarnitine，C2）比值显著增高。CPT-II主要表现为肉豆蔻酰肉碱（Myristoylcarnitine，C14）、棕榈酰肉碱（Palmitoylcarnitine，C16）显著增高。短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(Short Chain Acyl CoA Dehydrogenase Deficiency，SCAD)以丁酰肉碱（Butylcartine，C4）增高为主。中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(Medium Chain Acyl CoA Dehydrogenase Deficiency, MCAD)以辛酰肉碱（Octanoylcarnitine，C8）增高为主。极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(Very Long Chain Acyl CoA Dehydrogenase Deficiency，VLCAD)除C14显著增高外，伴C14:1显著增高。多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(Multiple Acyl CoA Dehydrogenase Deficiency，MADD)表现为多种酰基肉碱增高。

2.2            患儿串联质谱图

不同疾病患儿的串联质谱图见图1。从图中可以看出，不同的脂肪酸氧化代谢病所对应的酰基肉碱的离子强度显著增高。CPT-I患者C0离子峰强度显著增高；CPT-II患者C14、C16和C18:1离子峰强度显著增高；SCAD患者C4和C3离子峰强度显著增高；MCAD患者C8、C6和C10:1离子峰强度显著增高；VLCAD患者C10、C12、C14、C14:1、C16和C16:1离子峰强度显著增高。

2.3 临床资料分析

14例患儿中男9例，女5例，年龄均值1.9岁（14天～14岁）。CPT-I患儿为1岁男孩，表现为智力运动发育落后。CPT-II患儿9个月男婴，表现为黄疸、肝脏肿大，肝功能异常。SCAD患儿为2岁3个月女婴，表现为猝死。MCAD患儿7例，全为男孩，临床表现差异较大。其中1例年龄14天，表现为反复低血糖，酸中毒，5天后死亡；1例年龄6个月，表现为运动发育落后，反应差，肝脏肿大；1例年龄1岁6个月，表现为反复呕吐、智力运动发育落后；1例年龄为4岁，表现为智力、语言发育落后；1例年龄为8岁，主要表现为矮小，身高仅103cm，运动发育正常，智力轻度落后；1例年龄为11岁，表现为注意涣散，学习困难；1例14岁,表现为进行性肌无力。2例VLCAD患儿均为女婴，年龄分别为4个月和8个月,表现为反复抽搐，智力落后，肌力低下，肝脏肿大，肌酸激酶显著增高。2例MADD患儿男、女各一例，均为15岁，表现为突发肌无力，进行性加重，以致瘫痪，语言及吞咽困难，1例患儿肌酸肌酶高达7000IU/L，并伴肌红蛋白尿。预后，14例患儿中已知6例死亡，占43％，其中 CPT-I 1例，SCAD 1例，MCAD 2例，VLCAD 2例，除1例猝死患儿年龄2岁个月，其余5例均小于1岁。

3  讨论

脂肪酸b氧化障碍可发生在脂肪酸进入线粒体及其氧化过程的各个环节，酰基肉碱是脂肪酸和有机酸代谢的中间产物，根据不同长度碳链的酰基肉碱水平的变化可对脂肪酸代谢病进行筛查和诊断[4]。国外近几年利用串联质谱检测血液中酰基肉碱水平，用于脂肪酸代谢病的新生儿筛查和临床高危患者的诊断，发现脂肪酸代谢病的患病率较以往增高，其中MCAD最多见[5，6]。基因突变研究显示其存在985A>G热点突变[7]。本研究检测到14例脂肪酸代谢病，其中7例MCAD，说明在我国脂肪酸氧化代谢病并不少见，与欧美国家相似，以MCAD多见。

依据脂肪酸在线粒体内氧化代谢的机制，不同的肪酸代谢病表现为不同的酰基肉碱谱异常。CPT-I患儿除C0增高外，伴长链酰基肉碱的降低。Fingerhut[8]研究认为C0增高同时伴C0/(C16+C18)比值增高对诊断CPT-I更可靠，本研究诊断的CPT-I患儿C0/(C16+C18)比值为健康儿童的12倍，进一步支持本病的诊断。有报道CPT-II和VLCAD均可表现为C12、C14、14:1、C16、C16:1、C18和C18:1增高，CPT-II以C16增高显著，辅助(C16+C18:1)/C2比值作为诊断指标更敏感,VLCAD以C14、C14:1增高显著，辅助C14:1/C2或C14:1/C12比值作为诊断指标更敏感，结合比值可对这2种疾病进行区别[9*，10]。MADD患者由于多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏，导致体内多种酰基肉碱的畜积，串联质谱结果显示从短链到长链多种酰基肉碱增高。在某些遗传代谢病如瓜氨酸血症-II型、酪氨酸血症及半乳糖血症患者，可伴有长链酰基肉碱增高，但同时伴有氨基酸如瓜氨酸、甲硫氨酸或酪氨酸增高，故对于伴有氨基酸增高患儿应与氨基酸代谢病进行鉴别。。

脂肪酸氧化代谢病患儿临床表现无特异性，尤其是MCAD患儿表现多样。主要影响肝脏、心肌和肌肉，部分患儿可影响脑和肾脏。本研究确诊的患儿主要表现为运动发育落后、肌无力和肝肿大。常规实验室检查表现低血糖、酸中毒及肌酸肌酶显著增高。2例患儿猝死，可能与心脏受累有关。Dott等[11]对不明原因死亡的干血滤纸片重新进行串联质谱检测，诊断4例（0.5％）脂肪酸氧化代谢病，2例MCAD，2例VLCAD，提示猝死的病因之一为脂肪酸氧化代谢病。对于本病的治疗尚缺乏特效的方法，主要是避免饥饿，给予肉碱、生玉米淀粉治疗，部分患儿经过治疗病情明显好转。

本研究表明脂肪酸代谢病在我国并不少见，对于原因不明的肝肿大、肌无力、低血糖及运动、智力发育落后的患儿，应考虑到脂肪酸氧化代谢病的可能，及早检测酰基肉碱水平测定，以便诊断或排除脂肪酸氧化代谢病。

致谢：本研究得到全国各地的相关医生同行的支持，在此深表感谢！